心理应激干预大鼠颞下颌关节软骨中两种细胞因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.46.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (46): 8004-8011.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.46.005

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心理应激干预大鼠颞下颌关节软骨中两种细胞因子的表达

黄旭，肖朋，王艳，张红妤，刘海霞

新疆医科大学第二附属医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830028

出版日期:2013-11-12 发布日期:2013-11-30
通讯作者: 刘海霞，博士，主任医师，新疆医科大学第二附属医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830028
作者简介:黄旭★，男，1987年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事口腔修复学研究。 718761685@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(81360169)*

Psychological stress affects the expressions of two kinds of cytokines in rat temporomandibular joint cartilage

Huang Xu, Xiao Peng, Wang Yan, Zhang Hong-yu, Liu Hai-xia

Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830028, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Online:2013-11-12 Published:2013-11-30
Contact: Liu Hai-xia, M.D., Chief physician, Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830028, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Huang Xu★, Studying for master’s degree, Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830028, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China 718761685@qq.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360169*

摘要/Abstract

摘要：

背景：有动物建模方面的报道称心理应激可引起大鼠颞下颌关节疾病的发生，并有病理改变。
目的：观察心理应激对大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞血管内皮生长因子和转化生长因子β1表达的影响。
方法：将48只成年Wistar雄性大鼠随机分为实验组和对照组，其中实验组36只，对照组12只。对实验组施加电击、制动、气候箱、食物诱惑等刺激，使实验组大鼠处于心理应激状态。将实验组分别于刺激3周(刺激3周组)、刺激6周(刺激6周组)和刺激6周后正常饲养6周(恢复组)时间点各处死12只；对照组12只同实验组最后一批一起处死，取颞下颌关节标本制作切片。
结果与结论：恢复组血管内皮生长因子阳性率明显大于刺激3周组和对照组(P < 0.05)；刺激6周组转化生长因子β1阳性率明显大于对照组(P < 0.05)。表明血管内皮生长因子与新生毛细血管修复组织有关，转化生长因子β1在心理应激过程中可能起到了促进骨吸收的作用。

关键词: 组织构建, 组织构建与生物活性因子, 心理应激, 颞下颌关节, 颞下颌关节疾病, 关节软骨, 血管内皮生长因子, 转化生长因子β1, 免疫组化实验, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Animal modeling has reported that psychological stress can lead temporomandibular joint disease in rats, and there will be pathological changes.
OBJECTIVE: To observe the effects of psychological stress on the expressions of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-β1 in rat temporomandibular joint condylar chondrocytes
METHODS: Forty-eight adult male Wistar rats were randomly divided into the experimental group and the control group, 6 rats in the experimental group and 12 rats in the control group. Thirty-six Wister male adult rats in the experimental group were subjected to the following stimulating factors, such as electroshock, keeping stillness, climate change and food tempting in order to make them under psychological stress. Then, the experimental group rats were executed at 3 weeks after stimulation (3 weeks stimulation group), 6 weeks after stimulation (6 weeks stimulation group) and 6 weeks normal feeding after 6 week stimulation (recovery group), 12 rats were sacrificed at each time point. The 12 rats in the control group were executed at the same time as the last experimental group. The temporomandibular joint specimens were taken to produce slices.
RESULTS AND CONCLUSION: The vascular endothelial growth factor-positive rate of recovery group was significantly larger than that of the 3 weeks stimulation group and the control group (P < 0.05); transforming growth factor-β1 positive rate in the 6 weeks stimulation group was significantly greater than that in the control group (P < 0.05). It indicated that vascular endothelial growth factor was related with the new blood capillaries repairing tissue, and transforming growth factor-β1 might play a role that stimulates bone resorption in psychological stress.

Key words: stress, psychological, temporomandibular joint, vascular endothelial growth factors, transforming growth factor beta1

中图分类号:

R318

黄旭，肖朋，王艳，张红妤，刘海霞. 心理应激干预大鼠颞下颌关节软骨中两种细胞因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(46): 8004-8011.

Huang Xu, Xiao Peng, Wang Yan, Zhang Hong-yu, Liu Hai-xia. Psychological stress affects the expressions of two kinds of cytokines in rat temporomandibular joint cartilage[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(46): 8004-8011.

图/表（结果） 6

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引言

颞下颌关节紊乱病是指累及颞下颌关节及相应的软组织包括肌肉疼痛、异常关节音及下颌运动异常和伴有功能障碍为主要特征的一组疾病的总称, 是口腔临床最常见的疾病之一^[1] 。颞下颌关节紊乱好发于青壮年，患病率为 28%-83%，女性明显高于男性^[2-3] 。颞下颌关节紊乱病因较复杂，目前普遍认为颞下颌关节紊乱为多因素共同作用的结果，而非单一因素致病。主要的致病因素有心理因素、咬合关系紊乱、自身免疫因素、不良咀嚼习惯和关节局部解剖异常等^[4] 。长期以来，人们对本病的发病原因和致病机制、病理本质均认识不清，分类诊断标准不一，命名混乱，治疗方法虽多但针对性不强，疗效欠佳。随着基础研究和其他相关学科的不断发展，目前对该类疾病的病因、转归及治疗有了进一步的认识，采用了针对性强的、先进的诊断及治疗方法，临床疗效也有了显著提高。
越来越多的学者认为，心理社会因素，如焦虑、抑郁等情绪状态与颞下颌关节紊乱的发生、发展有很大的关系^[5] 。国内学者马绪臣和张震康于2005年提出了适宜中国人的颞下颌关节紊乱双轴诊断标准^[6] ，将心理因素纳入了颞下颌关节紊乱的诊断标准。肖朋等^[7]通过建立大鼠心理应激模型发现心理应激可引起大鼠颞下颌关节超微结构发生病理改变。
血管内皮生长因子具有促进血管内皮细胞分裂与增殖，增加微静脉、小静脉的通透性，诱导丝氨酸蛋白酶和间质胶原酶的表达，使细胞质钙聚集，诱导血管生成，在创伤愈合过程中起着重要的作用。转化生长因子β广泛存在于动物正常组织细胞以及转化细胞中，可调节细胞的增殖生长、分化凋亡和迁徙、控制细胞外基质的合成和降解，并通过免疫反应的调节而影响组织纤维化的形成和发展^[8] 。心理应激因素是否影响颞下颌关节组织中血管内皮生长因子、转化生长因子β1蛋白的表达发生改变，目前尚未见到相关的研究报道。
实验旨在人工干预条件下，对大鼠进行心理应激刺激，并制取新鲜颞下颌关节标本切片，采用免疫组织化学技术检测颞下颌关节组织血管内皮生长因子、转化生长因子β1蛋白的表达，以进一步探讨其在颞下颌关节紊乱的发生、发展中的关系及作用，阐明巨大心理压力对颞下颌关节的危害性。

材料方法

设计：完全随机设计。

时间及地点：实验于2012年8月至2013年2月在新疆医科大学动物实验中心及新疆医科大学第二附属医院病理科完成。

材料：

实验动物：48只成年雄性Wistar大鼠，体质量为(170±10) g，10周龄，清洁级，精神行为均等无异常，由新疆医科大学实验动物中心提供。

主要试剂：血管内皮生长因子、转化生长因子β1鼠抗人单克隆抗体、免疫组化SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒和EDTA组织抗原修复液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

实验方法：

动物分组：选择动物行为学评分相近的48只成年雄性Wistar大鼠，按随机化原则进行分组。分为两大组，实验组和对照组，实验组36只，对照组12只。实验组又根据刺激时间分为刺激3周组、刺激6周组、刺激6周再正常饲养6周组(简称恢复组)，每组12只。

实验组和对照组大鼠每笼饲养6只，实验组各笼中大鼠分别用苦味酸标记大鼠左前肢、左后肢、头部、尾部、右前肢和右后肢，以便识别和防止混乱。1号笼饲养1-6号，2号笼饲养7-12号，3、4、5、6号笼同理，依次为13-36号，7号笼和8号笼分别饲养对照组1-6号和7-12号。

饲养环境为新疆医科大学实验动物中心SPF级动物房，实验组和对照组大鼠分处不同的饲养房间，但基本条件一致，室温(20±3) ℃，光照时间为明/暗各12 h，背景噪声为(40±10) dB。大鼠喂养饲料由动物中心统一提供的标准棒状饲料，饮用自来水。实验组和对照组大鼠在同等条件下适应性饲养1周后，开始进行实验。

动物模型建立：实验组给予应激刺激，具体的刺激方式为：足底电击、制动、气候箱、食物诱惑刺激。足底电击刺激时间20-40 min，间隔刺激，通电10 s，间隔30 s，电压40 V(电刺激仪由冀星实验仪器有限公司制造)；制动(自制铁桶)刺激时间40-60 min；气候箱(上海精宏实验设备有限公司制造，温度为6 ℃、36 ℃交替，每3 h交替1次，伴风机转动噪声，100 dB；灯光明暗交替，每1 h交替1次)，刺激时间12 h；食物诱惑(食物装进敞口矿泉水瓶放于笼子上)，刺激时间16 h。每天选取2种或3种刺激方法，按照预定时间实施刺激。于相应时间点对照组与恢复组一同采用乙醚麻醉下颈椎脱臼法处死。处死大鼠后，即刻解剖，所取标本结构包括关节盘、髁状突和包绕髁突颈部的部分关节囊。将标本固定、脱钙、蜡块包埋。

颞下颌关节标本切片：将制备好的蜡块切成4 µm 厚的切片，连续切5张，在80 ℃烤箱内烤3 h以上，免疫组织化学染色方法采用链霉菌抗生物蛋白-过氧化酶联接法(S-P法)。每组设阴性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

主要观察指标：所有切片的观察经3名病理科医师独立在光镜下完成。每人均选择10个具有代表性的高倍视野(10×40倍)，采用半定量积分法判断结果，具体判断如下^[9]：①阳性细胞≤5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，> 75%为4分。 ②阳性强度：无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。将①、②两者积分相乘，0分为阴性(-)，1-4分为弱阳性(+)，5-8分为阳性(++)，9-12分为强阳性(+++)，若两位病理学专家结果相差3分则重新判定。

统计学分析：应用SPSS 17.0统计软件，进行多个样本的等级秩和检验，即H检验，组间多重比较采用H检验，检验水准α= 0.05，进行双侧检验。

讨论

在颞下颌关节紊乱的众多发病因素中，精神心理因素现已被国内外学者广泛关注。随着医学模式由单纯的生物医学模式向生物-心理-社会医学模式的转变，传统治疗有被物理疗法和心理疗法取代的趋势^[10] 。对于伴有长期心理紧张因素的颞下颌关节紊乱患者，心理应激因素可能为其主要致病原因，所以去除心理应激因素应该是治疗的必要手段，研究心理应激与颞下颌关节紊乱之间的关系，对于临床上指导颞下颌关节紊乱的治疗有重要意义。在对颞下颌关节紊乱发病机制的不断研究中，血管内皮生长因子和转化生长因子β1在颞下颌关节紊乱发展中的作用越来越受到重视。
血管内皮生长因子是由二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，能与肝素结合，分子质量为34-45 ku，NH2末端有特异的6个极性氨基酸组成的疏水基团，是分泌信号的标志。1983年，Senger等从豚鼠的腹腔肿瘤中分离得到一种蛋白因子，发现它可以诱导血清蛋白由血管渗漏而不引起血管内皮细胞的损伤，称为血管通透性因子，之后被认为是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，在体内有诱导血管生长、血管形成、内皮细胞增殖迁移，增加血管通透性的作用。
血管内皮生长因子是启动血管形成的一种具有高特异性的有丝分裂原，也是一种有效的血管通透性诱导因子，可以与血管内皮细胞受体进行紧密的、特异性的结合，进而促进血管内皮细胞进行有丝分裂，导致内皮细胞大量增生，逐渐形成了血管雏形，最后形成新的血管^[11] 。
血管内皮生长因子是迄今所发现的最重要的促血管生成因子，是目前认为作用最强、特异性最高的促血管生成因子，它可通过血管内皮上的受体介导的受体信号转导通路，促进血管内皮细胞增殖、迁移，阻止血管内皮细胞凋亡和管腔网状结构退化，增加血管渗透性。研究表明^[12] ，血管内皮生长因子表达与血管生成明显呈正相关，故血管内皮生长因子能较好地反映新生血管生长的活跃程度。血管内皮生长因子在正常成人与动物组织中表达水平较低，但在胎儿及正在进行生理性血管生长的组织中表达水平较高^[13] 。
血管内皮生长因子最主要的生物学作用是可以促进动脉、静脉，以及淋巴管来源的内皮细胞的生长^[14] 。自身内源性的血管内皮生长因子是机体组织损伤恢复重要的血管生长因子，Wagatsuma^[15]通过动物实验证实，肌肉损伤后早期血管内皮生长因子及其受体的mRNA表达明显增高，与损伤早期的血管化程度密切相关，从而也间接说明了血管内皮生长因子的重要的血管化作用。治疗性血管生长素是治疗缺血性血管疾病的一个新概念，它包括诱导血管发生、小动脉生成及淋巴管生成^[16] 。在血管生长中，血管内皮生长因子调节内皮细胞胞外基质溶解、内皮细胞迁移、增生以及管腔形成。其过程主要包括以下步骤^[17] ：①血浆的外渗，新生血管外基质的构筑。②新生血管芽雏形的形成。③血管芽的发育和扩展。④新生血管的成熟和改建。血管内皮生长因子通过增加血管通透性，使血管内纤维蛋白原等血浆蛋白外渗，纤维蛋白原与血管外渗纤维连接蛋白等多种成分凝结形成交叉的纤维蛋白凝胶体，为内皮细胞、成纤维细胞的迁移提供一个纤维网络，有利于血管生成。血管内皮生长因子在多种体内模型中的促血管生成作用已经被多个实验所证实^[18] 。
血管内皮生长因子基因的表达受缺氧、多种细胞因子、类固醇激素、瘤基因、抑瘤基因产物及一些小分子物质等因素的调控。目前认为，缺血或缺氧是诱导血管内皮生长因子表达的最主要因素，血管内皮生长因子能随氧浓度的变化迅速上调达10倍以上。血管内皮生长因子可表达于成纤维细胞、角朊细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等，其主要生物学功能就是促进血管形成。肿瘤坏死因子α、转化生长因子β、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白细胞介素1、表皮生长因子、前列腺素E等，均能使血管内皮生长因子及其受体表达上调，提高其生物学活性^[19] 。
缺氧条件下机体组织血管内皮生长因子表达上调，血管内皮生长因子合成增多，其作用机制可能为：①缺氧诱导因子诱导启动血管内皮生长因子的转录，缺氧诱导因子受氧气和生长因子的调节，可以激活正常的缺氧感受基因，缺氧诱导因子可以在数分钟内使血管内皮生长因子增加30倍，从而调控血管内皮生长因子表达^[20] 。②在缺氧环境下培养细胞，结果发现细胞内血管内皮生长因子的表达及mRNA水平明显增高，提示缺氧可导致血管内皮生长因子的表达及释放，并且是促血管生成的因素之一^[21] 。③缺氧使得一种核内核糖蛋白与血管内皮生长因子mRNA非翻译区的富含Au元件形成RNA-蛋白复合物，可显著延长血管内皮生长因子mRNA在体内的半衰期，从而间接提高血管内皮生长因子的生理活性^[22] 。
血管内皮生长因子是迄今所发现的最重要的促血管生成因子，在颞下颌关节中，血管内皮生长因子是由患有骨关节炎的软骨细胞产生，在髁突软骨的生长过程中对血管的形成过程起重要作用。正常的关节软骨是无血管的组织，其所需营养由滑液供给，有研究发现这可能与关节软骨自身产生血管生成抑制物，抑制软骨中血管组织的形成有关系^[23] 。有研究表明，血管内皮生长因子在骨关节软骨中的表达与新血管的生成有关，对骨关节病的发生有着重要的作用^[24] 。
然而有关心理应激状态下，颞下颌关节内血管内皮生长因子之表达和作用如何目前并无研究，作者假设了在有病理改变的关节组织中，软骨的变化是由于血管生成的结果，那么血管内皮生长因子的表达可以说明这一病理的过程。血管内皮生长因子是目前已知的促血管形成的主要细胞因子。有确定的证据表明血管内皮生长因子参与了颞下颌关节内病理性的新血管化，并伴随关节盘软骨内滑膜组织和骨关节炎及风湿性关节炎液体中的因子数量增加^[25] 。
血管内皮生长因子在生长中的髁突软骨的血管形成过程中扮演着十分重要的角色。据报道，它存在于慢性炎症滑膜的增殖区域，在这些区域中，血管的形成增多。值得强调的是，在这些区域中血管内皮生长因子会导致一个炎症过程。而这个炎症过程是通过巨噬细胞的趋化和血管形成的促进而形成的^[26] 。Sato等^[27]发现在关节盘移位患者滑膜组织中，血管内皮生长因子及其受体flt-1的表达与微血管密度有明显关系。
血管内皮生长因子促进滑膜组织中血管内皮细胞增殖，同时诱导其表达尿激酶型和组织型纤溶酶原激活剂，进而活化纤溶酶，导致基质金属蛋白酶激活降解血管周围胞外基质，从而有利于血管内皮细胞游走到炎症组织处增殖形成新的血管网。血管内皮生长因子通过诱导血管生成，维持关节炎症状态，导致滑膜及关节盘软骨增生、充血。同时，血管内皮生长因子趋化单核细胞定向游走到滑膜炎症区域，直接导致滑膜炎症。Dvorak等^[28]认为血管内皮生长因子通过增加囊泡细胞器的功能使血管内皮细胞通透性增加。血管通透性增加可导致多种炎症因子(白细胞介素1β，白细胞介素6，肿瘤坏死因子α，P物质，前列腺素E2)释放入关节腔，使滑液质和量都发生改变，导致关节软骨和关节盘的润滑及营养障碍^[29-30] 。同时，滑液中的白细胞介素1β，白细胞介素6，前列腺素E2可上调滑膜组织血管内皮生长因子mRNA的表达^[31] ，从而形成正反馈，导致关节病变持续发展。
作者这次实验结果显示恢复组血管内皮生长因子阳性表达率明显高于对照组和刺激3周组，且大鼠颞下颌关节组织切片中可以发现关节软骨有新生毛细血管修复现象，表明恢复组中血管内皮生长因子的高表达与新生毛细血管对组织的修复有关。刺激6周组血管内皮生长因子阳性表达率稍高于对照组和实验3周组，但无统计学意义，可能在长时间应激条件下组织破坏的同时，开始伴随着血管内皮生长因子血管新生修复现象，但血管内皮生长因子的表达调控有待进一步研究。
转化生长因子β广泛存在于动物正常组织细胞以及转化细胞中，是具有多种生物效应的细胞调节因子。在哺乳动物中的转化生长因子β有3种，分别为转化生长因子β1、转化生长因子β2和转化生长因子β3^[32] 。其中转化生长因子β1在体细胞中所占比例最高(90%)，活性最强^[33] 。软骨的改建包括骨生成和骨吸收两种过程, 有多种细胞因子参与调节。转化生长因子β1是骨生成和骨吸收过程中最具有代表性的因子之一。转化生长因子β1有较强的成骨和成软骨作用^[34] ，它可启动骨和软骨的形成，调节成骨细胞及成软骨细胞的分化，加速成骨过程，同时还具有调节破骨细胞的功能，对其他激素及生长因子也有调控作用^[35] 。
转化生长因子β是一种多功能细胞因子，广泛参与哺乳动物的各种病理生理过程，在关节的生长发育、正常功能结构的维持以及疾病过程中，均发挥着重要作用，因此在颞下颌关节研究中时有报道^[36-38] 。近年来的研究发现，转化生长因子β以及血管内皮生长因子等多种因子参与髁突软骨的改建^[38-39] 。
软骨的改建包括骨生成和骨吸收两种过程, 其中多种细胞因子参与调节。转化生长因子β1是骨生成和骨吸收过程中最具有代表性的因子之一。转化生长因子β1有较强的成骨和成软骨作用^[40] 。其中转化生长因子β1可启动骨和软骨的形成，调节成骨细胞及成软骨细胞的分化，加速成骨过程，同时它还具有调节破骨细胞的功能，对其他激素及生长因子也有调控作用^[41-44] 。也有研究表明，转化生长因子β参与了骨和软骨的组织的形成，在骨折愈合的过程中，于骨痂形成期含量增加，同时体外免疫组化研究证实了软骨痂中转化生长因子β大量表达，说明其在软骨细胞增殖、分化和软骨基质合成过程中发挥了重要的调节作用^[45-46] 。转化生长因子β对关节软骨组织非常有益，体内外实验发现，它可以刺激软骨细胞增加蛋白多糖合成和Ⅱ型胶原的表达^[47-48] 。
本实验结果显示刺激6周组转化生长因子β1表达阳性率明显高于对照组，组织病理标本显示刺激6周组髁突软骨细胞破坏程度最重，可能是转化生长因子β1调节破骨细胞的功能强，而成骨作用弱。实验3周组和恢复组转化生长因子β1表达阳性率也稍高于对照组，但差异无显著性意义，受到刺激时间以及适当恢复的影响，转化生长因子β1在心理应激过程中可能起到了促进骨吸收的作用，相对来说成骨的作用较弱，也可能转化生长因子β1发挥着调控多种细胞因子的作用。
大鼠颞下颌关节中的诸多细胞因子之间可能存在着相互作用机制。kafas等^[49]报道，外源性的转化生长因子β1能增加血管内皮生长因子的表达，推测转化生长因子β1促血管生成的作用可能是通过血管内皮生长因子的旁分泌途径诱导血管内皮生长因子的表达，再引起血管内皮细胞的生长而实现的。关于转化生长因子β1和血管内皮生长因子的协同作用机制，目前的研究表明转化生长因子β1能促进血管内皮生长因子蛋白在成纤维细胞和血管内皮细胞的生物合成，但转化生长因子β1 却不能显著促进血管内皮生长因子在血管内皮的表达，对体外培养的血管内皮细胞也没有明显的促有丝分裂作用^[50] 。总之，各细胞因子之间的相互影响与调控还需进一步研究。

心理应激干预大鼠颞下颌关节软骨中两种细胞因子的表达

Psychological stress affects the expressions of two kinds of cytokines in rat temporomandibular joint cartilage

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